CRISPR를 사용하여 인간 노로바이러스 유전자형 GII.4 또는 GII.17의 초고감도 및 시각적 검출

바이러스학 저널 19권, 논문 번호: 150(2022) 이 기사 인용

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등온 신호 증폭과 CRISPR-Cas12a 센서를 통합하면 인간 병원체 진단을 위한 저비용, 일회용 및 초민감 분석법을 개발할 수 있습니다.

노로바이러스(NOV) 유전자형 GII.4 또는 GII.17의 직접 검출을 위한 RT-RAA-Cas12a 매개 실시간 또는 종점 형광 및 측면 흐름 스트립(LFS) 분석을 탐구했습니다.

결과는 우리의 RT-RAA-Cas12a 매개 형광 및 LFS 분석이 바이러스 단백질 1 유전자를 표적으로 삼아 NOV GII.4 또는 GII.17을 검출할 수 있음을 보여주었습니다. 우리의 RT-RAA-Cas12a 매개 형광 및 LFS 분석은 다른 관련 바이러스에 대한 교차 반응 없이 NOV GII.4 또는 GII.17을 구체적으로 감지할 수 있습니다. 검출 하한은 약 30~40분 내에 0.1 copy/μL에 도달할 수 있으며, 결과는 자외선 조명기를 사용하거나 복잡한 장비 없이 LFS를 사용하여 시각화되었습니다. 또한 RT-RAA-Cas12a 매개 형광 및 LFS 분석은 95.7% 및 94.3% 양성 예측 일치와 100% 음성 예측 일치로 실시간 RT-PCR 분석에 대한 시각적이고 빠른 대안을 제공했습니다.

함께, 우리의 RT-RAA-Cas12a 중재 접근법은 자원이 제한된 환경에서 NOV GII.4 및/또는 GII.17의 현장 진단에 큰 잠재력을 가질 것입니다.

인간 노로바이러스(NOV)는 현재 모든 비세균성 위장염의 주요 원인으로 인식되고 있습니다[1]. NOV는 건강한 어린이와 성인 모두에게 일반적으로 48시간 동안 지속되는 급성 구토 및 설사와 같은 증상을 유발할 수 있는 RNA 바이러스 그룹입니다. NOV는 소수의 입자라도 질병을 일으킬 수 있고 감염된 개인이 많은 양의 바이러스를 배출하기 때문에 전염성이 높습니다[2, 3]. NOV는 주로 NOV에 감염된 사람의 대변과의 직간접적인 접촉으로 인해 오염된 음식과 물에 노출되거나[4], 감염된 개인의 구토에 의해 생성된 에어로졸을 통해 사람에게 전염됩니다[5]. NOV의 높은 감염성과 효율적인 전파 능력으로 인해 병원, 요양원 등 폐쇄된 지역사회 환경에서 전 세계적으로 NOV의 발생이 보고되고 있으므로 공격적인 감염을 줄이기 위한 개입 조치가 필요합니다[6].

인간 노로바이러스는 10개의 서로 다른 유전자군(GI-GX)과 최소 48개의 확인된 유전자형으로 엄청난 유전적 다양성을 보유하고 있습니다[7]. NOV의 유전자군 GI, GII 및 GIV는 인간 감염과 관련이 있는 것으로 알려져 있습니다. NOV GII의 약 21개 유전자형 중 GII.4 유전자형은 지난 10년 동안 NOV의 돌발 감염 임상 사례의 대부분을 담당했습니다[8]. 최근 NOV의 GII.17이라는 새로운 유전자형이 출현하여 빠르게 확산되어 아시아 일부 지역에서 NOV의 주요 균주가 되었으며, 이는 추가적인 발병 위협의 위험을 제기하고 있습니다[9]. 지금까지 인간을 대상으로 한 효과적인 항바이러스 치료에 대한 소수의 보고 외에[10], 현재 인간을 대상으로 허가된 NOV 백신은 없습니다[11]. 결과적으로, NOV 감염을 보다 신속하고 조기에 발견하는 것은 조기 개입, 치료 및 감염 예방을 촉진하는 데 중요한 역할을 하며, 결과적으로 감염성 바이러스의 전염 위험을 완화할 수 있습니다.

NOV를 검출하기 위한 현재 최적의 표준은 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR), 중첩 RT-PCR 및 실시간 RT-PCR을 포함한 분자 기술입니다[12]. 이러한 방법 중에서 실시간 RT-PCR은 민감도와 특이도가 높고 이월 오염 위험이 낮기 때문에 NoV 감염을 검출하거나 진단하는 데 광범위하게 사용되었습니다. 현재, 상업적으로 이용 가능한 다양한 실시간 RT-PCR 분석은 NoV GI의 경우 10-50 게놈 복사본/반응, NoV GII의 경우 1-300 게놈 복사본/반응에서 실시간 RT-PCR의 민감도를 입증했습니다[13]. 그러나 실시간 RT-PCR 방법은 일반적으로 정교한 장비와 고도로 숙련된 인력에 의존하고 평균 반응 시간이 ~ 2시간으로 단순하고 신속하며 현장 진료(POC)에는 적합하지 않습니다. ) 일상적인 탐지를 위해 자원이 제한된 지역에서 NOV 감염을 진단하기 위한 분자 분석. 최근 연구에서 Sun et al. NOV의 GII.4 및 GII.17 유전자형을 검출하고 구별하기 위한 종이 기반 비색 방법을 제시했습니다[14]. 그러나 이 방법을 이용한 검사는 상대적으로 오랜 시간(~3시간)이 필요하고 검출 범위도 2.6fM~0.5pM으로 제한되어 RT-PCR에 비해 민감도가 떨어진다[14]. 반대로, 우수한 신속성, 민감도 및 특이성으로 인해 규칙적으로 간격을 두고 있는 짧은 회문식 반복 서열(CRISPR)과 CRISPR 관련(Cas) 뉴클레아제로 구성된 RNA 유도 클러스터형 뉴클레아제 기반 핵산 검출 시스템은 최근에 상당한 잠재력을 보여주었습니다. 감염성 병원체에 대한 차세대 POC 분자 진단을 활용합니다[15,16,17]. 현재 Cas12a, Cas12b, Cas13a 및 Cas14를 포함한 여러 버전의 Cas 뉴클레아제의 효능이 시험관 내 및 생체 내 분석 모두에서 평가되었습니다[18,19,20,21]. 이러한 뉴클레아제 중에서 Cas12a(이전 Cpf1)는 클래스 II 유형 V 엔도뉴클레아제입니다. RuvC 뉴클레아제 도메인을 포함하는 Cas12a는 T가 풍부한 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열을 포함하는 단일 CRISPR RNA(crRNA)에 의해 안내되어 특정 부위에서 이중 가닥 DNA(dsDNA)를 절단하거나 PAM 없이 비특이적 ssDNA 절단을 수행합니다. in trans in vitro [18]. 더욱이 Cas12a 뉴클레아제와 재조합 중합효소 증폭(RPA) 또는 역전사-RPA(RT-RPA)를 결합하는 것은 DNA 엔도뉴클레아제 표적 CRISPR 트랜스 리포터(DETECTR) 시스템을 개발하기 위해 철저하게 연구되었으며 핵산 검출의 민감도와 특이성을 크게 향상시킵니다. 18].